Nato il 12 marzo 1819 a Isola del Liri da famiglia benestante, frequenta il Collegio Tulliano di Arpino, studiando sia materie classiche che scientifiche. Si sposta poi a Napoli per studiare medicina, laureandosi nel 1845. In realtà all’Università di Napoli frequenta anche corsi di approfondimento della lingua italiana, dei classici antichi, della filosofia, delle lingue straniere.
Per motivi familiari, tuttavia, Nicolucci deve tornare al paese natale, lasciando la ricerca e iniziando la professione di medico. Da solo e in privato continua a studiare. I suoi interessi riguardano l’antropologia. Convinto che l’umanità si divida in razze, il suo obiettivo è ordinarle in un minuzioso albero genealogico. Per questo inizia a descrivere con la maggiore definizione di dettaglio possibile le varietà umane, utilizzando sia parametri fisiognomici e antropometrici, sia informazioni etnografiche.
Nel 1852 compie un viaggio in Europa ed entra in contatto con numerosi studiosi stranieri, coinvolti nello sviluppo dell’antropologia. Inizia così a organizzare una collezione di crani.
Nel 1858 pubblica il libro "Delle razze umane", che lo consacra tra i grandi dell’antropologia in Europa, anche perché propone un approccio multidisciplinare al nuovo campo di studi.
Con l’Unità d’Italia si candida al parlamento, viene eletto ed è deputato fino al 1865. Finita la parentesi parlamentare, tra il 1867 e il 1869 pubblica due importanti saggi, "Sull’Antropologia della Grecia" e "Antropologia dell’Etruria". Intanto inizia a occuparsi di paleoantropologia e dei primi manufatti litici. Nel 1880 ottiene la cattedra di Antropologia istituita per lui a Napoli, presso la Facoltà di Medicina e Chirurgia. Nei due decenni successivi la sua produzione è notevole: ormai è un evoluzionista convinto e già nel 1886 scrive l’"Antropologia dell’Italia nell’Evo antico e moderno", dove esamina tutti i popoli la cui presenza è stata accertata in Italia, tracciandone un profilo non solo fisico ma anche culturale. Nel 1881 fonda a Napoli il Museo di Antropologia, annesso all’Istituto di Etno-Antropologia. Giustiniano Nicolucci muore nella natia Isola del Liri nel 1904.